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microRNA和piRNA研究


AGO蛋白家族

AGO蛋白家族是指与以小分子RNA(small RNA)为介质的遗传基因发现控制机构有关的蛋白质群。基于氨基酸序列的相似性,AGO蛋白家族又分为AGO亚族与PIWI亚族,已发现在生殖细胞、干细胞(ES、iPS等)中有表达。
和光纯药公司推出了众多用于对miRNA和mRNA (存在于细胞和组织中的RISC的组成成分)进行功能分析的工具,这些工具不仅适用于对miRNA的分析,同时也适用于对靶标mRNA的分析。

 

AGO蛋白家族

AGO亚族 PIWI亚族

AGO1, AGO2, AGO3, AGO4

PIWIL1 / HIWI, PIWIL2 / HILI, PIWIL3, PIWIL4 / HIWI2

AGO1, AGO2, AGO3, AGO4

PIWIL1 / MIWI, PIWIL2 / MILI, PIWIL4 / MIWI2

RNA结合蛋白

microRNA、siRNA等

piRNA等




【和光产品信息】

1. microRNA研究

PDFPDF(908KB/8P)

microRNA(简称miRNA)是一种长约22个nt(核苷酸)的内源性RNA分子,通过与靶标mRNA的互补配对,可抑制mRNA的裂解和翻译,从而在动植物体内发挥重要的调控作用。据推测,在人体和鼠体内存在上千种miRNA,因此对于miRNA的各种研究(例如对功能不明的新型miRNA的鉴定以及对与特定疾病相关的miRNA功能的说明等)迅速发展成为一大研究领域。近来,血清中存在miRNA这一重大事实的发现,开创了利用miRNA作为生物标志物进行包括癌症在内的疾病治疗的医学未来。一般认为,microRNA发挥作用的方式如下: 先在细胞中经过多个阶段发育成熟,再与蛋白质结合生成蛋白质复合物“RISC”(“RNA诱导沉默复合物”),然后与RISC主要组成部分AGO亚族蛋白结合,最后再与靶标mRNA结合,从而达到降解mRNA链或抑制翻译的目的。
人体中存在4种AGO亚族蛋白(hAgo1~hAgo4),可泛表达基因信息,但表达水平因类型而异。在AGO亚族蛋白中,只有AGO2具备对靶标RNA裂解的切割酶活性,因此是一种最具表达水平的蛋白质,可在miRNA合成途径中发挥至关重要的作用。由于RISC能够与AGO蛋白抗体发生免疫沉淀,因此可从RISC沉淀物中回收miRNA;而且进一步研究表明,靶标miRNA为共沉淀剂,因此免疫沉淀成法为研究miRNA功能的基本方法。
鉴于上述情况,和光纯药特别推出了众多对miRNA功能进行分析的工具,其中主要为利用抗AGO抗体的miRNA研究工具。通过组合使用上述工具,即可实现对miRNA和mRNA(存在于细胞和组织中的RISC的组成成分)的综合分析— miRNA分析和靶标mRNA分析。

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(1) microRNA纯化试剂盒系列:

一种基于利用AGO蛋白抗体的免疫沉淀方法

  特性:
  • 1)适用于内源性AGO蛋白的免疫沉淀法
  • 2)miRNA与AGO蛋白结合的纯化性能高
  • 3)其他RNA(如rRNA(核糖体)和RNA的降解片段)的污染度低
  • 4)适用于microRNA的高效克隆以及纯化microRNA成分的微阵列技术(测定基因表达谱的方法和技术)
  • microRNA提取试剂盒,人/鼠AGO1(10次反应;和光Cat.No.:291-70201)
  • microRNA提取试剂盒,人AGO2(10次反应;和光Cat.No.:292-66701)
  • microRNA提取试剂盒,鼠AGO2(10次反应;和光Cat.No.:292-67301)
  • microRNA提取试剂盒,人AGO3(10次反应;和光Cat.No.:297-70301)

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(2)cDNA编码microRNA试剂盒的制备

和光纯药microRNA克隆试剂盒可以用于制备cDNA编码microRNA,只需在microRNA片段制备后的1.5日之内即可完成克隆过程。该试剂盒中含有从虾中提取的碱性磷酸酶(SAP),能与其中的耐热性单链DNA连接酶(另售)和原改良接头发生连接反应。与传统方法(利用从细菌中提取的碱性磷酸酶和T4 RNA连接酶)相比,克隆效率显著提高。

  特点:

  • 1) 耐热性连接酶能够实现接头的准确连接,从而提高克隆效率
  • 2) 适用于microRNA克隆以形成二级结构
  • 3) 操作简单,只需在1.5日之内即可生成cDNA编码microRNA

  • 和光microRNA克隆试剂盒(8次反应;和光Cat.No.:290-66501)
    接头连接高效、准确、简捷

  • 耐热性单链DNA连接酶重组体解决方案(200个单位(和光Cat.No.:298-65103);500个单位(和光Cat.No.:292-65101)

  • 和光靶标mRNA克隆试剂盒(10次反应;和光Cat.No.:298-68001)
    和光纯药生产的靶标mRNA克隆试剂盒用于借助微量mRNA实现cDNA扩增,尤其是利用AGO IP RNA片段实现microRNA靶标mRNA克隆。扩增后的cDNA将成为microRNA的靶标mRNA。    

      特点:

    • 1)方法简易
    • 2)具备实现微量mRNA扩增的性能
    • 3)cDNA扩增方式不依赖于mRNA的长度
    • 4)适用于microRNA靶标mRNA的研究

  • 和光PCR纯化试剂盒(30次反应(和光Cat.No.:298-67901)
    和光纯药生产的PCR纯化试剂盒,用于在利用RT-PCR或PCR完成DNA合成后的仅10分钟内去除在各种分子生物学试验反应缓冲液中形成的引物、引物二聚体、dNTP(三磷酸脱氧核苷酸)以及诸如DNA聚合酶、限制性内切酶等多种酶。

  • THUNDER Taq Gold DNA聚合酶(不含镁离子的缓冲液)
    (250个单位;和光Cat.No.:317-07081):PCR(聚合酶链式反应)用耐热性DNA聚合酶
    建议采用THUNDER Taq Gold DNA聚合酶(不含镁离子的缓冲液)来抑制非特异性扩增。THUNDER Taq Gold DNA聚合酶用于PCR的热启动,在进入PCR循环前,在95℃的温度下经过10分钟的热处理后被活化。由于利用THUNDER Taq Gold DNA聚合酶(不含镁离子的缓冲液)方式实现扩增后的DNA片段是一种腺嘌呤的3'末端, 因此能够直接插入到T载体中。

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(3) 抗体

  • AGO1抗体、单克隆抗体(1F2)
     (50μL(和光Cat.No.:018-22401))〈用于蛋白质印迹法〉
  • AGO1抗体、单克隆抗体(2A7)
     (50μL(和光Cat.No.:015-22411))〈用于免疫沉淀法〉
  • 抗人AGO2抗体、单克隆抗体(4G8)
     (50μL(和光Cat.No.:011-22033);100μL(和光Cat.No.:015-22031)
     〈用于蛋白质印迹法、免疫沉淀法以及免疫细胞化学染色法〉
  • 抗小鼠AGO2抗体、单克隆抗体(2D4)
     (50μL(和光Cat.No.:014-22023);100μL(和光Cat.No.:018-22021)
     〈用于蛋白质印迹法、免疫沉淀法以及免疫细胞化学染色法〉
  • 抗人AGO3抗体、单克隆抗体(1C12)
     (50μL(和光Cat.No.:018-23241))〈用于免疫沉淀法〉

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2. piRNA研究

  • PIWIL1抗体、单克隆抗体(2C12)
    (100 μL (和光Cat.No.:017-23451))〈用于免疫沉淀法〉

      特点:

    • 1) 可免疫沉淀内在性PIWIL1蛋白质。(5~10µg浓度为10%的蛋白G微珠)
    • 2) 可免疫沉淀PIWI1结合piRNA。
    • 3) 可在人、鼠的组织和细胞中使用。

    使用例:
    (1) 小鼠精巢中内源性PIWIL1的免疫沉淀(IP)-1
    Lane 1: NEC14 cells, mouse IgG IP分级 (1/2 vol.)
    Lane 2: NEC14 cells, 2C12 IP分级 (1/2 vol.)
    Lane 3:小鼠 精巢 IgG IP分级 (1/2 vol.)
    Lane 4:小鼠精巢, 2C12 IP分级 (1/2 vol.)

    Cell number: 1 x 107 cells
    组织(小鼠精巢)重量 25mg
    第一抗体(蛋白质印迹)
      Anti PIWIL1 polyclonal antibody
        (gifted from Dr. Miyagawa, Osaka Univ.)
        This antibody is not available from Wako.

    (2) 小鼠精巢中内源性PIWIL1的免疫沉淀(IP)-2

    Lane M:分子量Marker
    Lane 1:小鼠IgG IP分级 (1/2 vol.)
    Lane 2: 2C12 IP分级 (1/2 vol.)
    组织(小鼠精巢)重量 25mg
    第一抗体(蛋白质印迹)
      Anti PIWIL1 polyclonal antibody
        (gifted from Dr. Miyagawa, Osaka Univ.)
        This antibody is not available from Wako.

    (3) PIWIL1结合piRNA的精制

    Lane M:分子量Marker
    Lane 1:小鼠IgG IP RNA 分级 (1/2 vol.)
    Lane 2: 2C12 IP RNA 分级 (1/2 vol.)
    组织(小鼠精巢)重量 25mg

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