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標的mRNAスクリーニングに使用できます。
Target mRNA Cloning Kit Wako

Target mRNA Cloning Kit Wako は微量mRNA をcDNA 増幅するキットです。
本品は、Ago タンパク質の免疫沈降RNA 画分に存在するmicroRNA と相互作用するmRNA をcDNA 化することが可能なキットです。それらのmRNA から合成されたcDNA をクローニングして得られたDNA 配列をもとに、microRNA の標的mRNA候補をスクリーニングできます。
本キットをAgo 免疫沈降法と併用することで、従来のデータベースを用いた標的mRNA の予測法ではなく、分子生物学的手法によりmicroRNA の標的mRNA のスクリーニングが可能になりました。

Target mRNA Cloning Kit Wako 製品情報

1)　特長
2)　キット内容
3)　取扱い説明書（Instruction Manual）
4)　原理
5)　使用例（miR-122 標的mRNA の探索）
6)　参考文献
7)　価格


リーフレット（日本語）
Leaflet（English Version）

特長

● シンプルなプロトコール
● 微量mRNA 増幅に最適
● mRNA 鎖長に影響されずに増幅可能
● Ago 免疫沈降との併用で標的mRNA 探索が可能

キット内容（10回用）

Target mRNA Cloning Kit Wakoは、14本の構成部材からなります。

(1)dT(20)-RT Primer(20pmol/μL) 10μL×1本
　　5'-GACCATATGACGAGATCCGAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'　（45mer）
(2)10×RT Buffer 20μL×1本
(3)dNTP Mixture Solution (2.5mmol/l each) 20μL×1本
(4)RNase Inhibitor(20U/μL) 10μL×1本
(5)Reverse Transcriptase(200U/μL) 10μL×1本
(6)0.5 mol/L EDTA Solution 20μL×1本
(7)1mol/L Tris-HCl Solution 200μL×1本
(8)Ethachinmate 30μL×1本
(9)10mol/L Ammonium Acetate Solution 480μL×1本
(10)2nd Strand Synthesis Primer(20pmol/μL) 10μL×1本
　　5'-CATGGTATCGACGAGACTGAGGCTGNNNNNNNNNB -3'（35mer）
(11)5' PCR Primer(20pmol/μL) 10μL×1本
　　5'-CATGGTATCGACGAGACTGAG-3'（21mer）
(12)3' PCR Primer(20pmol/μL) 10μL×1本
　　5'-GACCATATGACGAGATCCGAG-3'（21mer）
(13)5' Colony PCR Primer(5pmol/μL) 960μL×1本
　　5'-GTATCGACGAGACTGAGGCTG-3'（21mer）
(14)3' Colony PCR Primer(5pmol/μL) 960μL×1本
　　5'-CGAGATCCGAGCTTCTTTTTT-3'（21mer）

＜本キット以外に必要なもの＞
(1) DNA増幅用酵素
耐熱性DNA合成酵素を使用する場合、ホットスタートPCR用の酵素をご使用下さい。
ニッポンジーン社のHOTGoldstarTM DNA Polymerase(コードNo. 314-80251, 310-80253)をお奨めします。
HOTGoldstarTM DNA Polymeraseは、PCRサイクルに入る前に95℃で10分間の熱処理によって酵素の活性化を行い、非特異的増幅を最小限に抑えることができます。
また、本酵素によって増幅された2本鎖DNA断片は、3'末端にAが突出しますので、T-ベクターに直接ライゲーション可能です。

(2)　PCR Purification Kit Wako(コードNo. 298-67901)
PCR Purification Kit Wakoは、操作時間わずか10分間でRT-PCRやPCRによるDNA合成後に反応溶液中に含まれるプライマー、プライマーダイマー、dNTP、酵素を除去することができます。
PCR Purification Kit Wako の取扱い説明書、製品情報はこちら

その他必要試薬の詳細は下記のTarget mRNA Cloning Kit Wako取扱説明書をご参照ください。

取扱い説明書（Instruction Manual）はこちら

原理

使用例（miR-122 標的mRNA の探索）

＜実験の流れ＞

＜�@ 増幅されたcDNA の電気泳動結果＞

＜�A標的mRNA のクローニング結果＞
本キットを使用してAgo2 IP RNA 画分からクローニングされたmiR-122 の標的配列を有するcDNA クローン

※１ CSP：Context Score Percentile
標的としての妥当性を示すパラメーター値（TargetScan）。
値が100 に近似するほど標的mRNA としての信頼性が高いことを示す値。


＜�B 定量PCR による標的mRNA の検証＞
mRNA 定量PCR の結果（CSP※1 ≧ 80 のクローンで検証）



※ ２ Control 細胞
miR-122 導入HepG2 細胞のネガティブコントロールとして、ルシフェラーゼGL3 siRNA を導入したHepG2 細胞。

＜結果＞
Ago2 IP RNA画分を用いてTarget mRNA Cloning Kit WakoでcDNA増幅することにより、miR-122 の既知標的ALDOA に加え、新規の標的mRNA の候補が得られた。

参考文献

Hayashida, Y., et al . : A useful approach to total analysis of RISC-associated RNA., BMC Research Notes , 2, 169（2009）

価格

Target mRNA Cloning Kit Wako と必ず併用して下さい。

●本文に記載されております試薬は、試験、研究の目的のみに使用されるもので、「衣料品」、「食品」、「生活用品」などとして使用できません。　
●希望納入価格には消費税等が含まれておりません。